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늦었네요 ㅠ
이번에도 이번 학기 조교님과 함께한 영상입니다.
모두모두 이번 학기 마무리 화이팅 ⭐️
#이거하나면레포트끝 #사수가무서울땐효린세스 #생화학실험
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12주차 SDS-PAGE을 이용한 protein 분리 결과보고서
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- Date Published: 2020. 6. 11.
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12주차 SDS-PAGE을 이용한 protein 분리 결과보고서
12주차 SDS-PAGE을 이용한 protein 분리 결과보고서
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SDS-PAGE & 2D gel electrophoresis & etc
단세포가 되고파
이번 포스트에서는 정제한 단백질을 분석(analyze)하는 방법에 대해 알아보도록 할게요.
본격적으로 시작하기에 앞서,
단백질을 분석할 수 있는 방법은 엄~~~~~~~~~청 많다는거를 아셔야 해요 ㅋㅋㅋㅋㅋ
그 중에서 아주 기본 중의 기본에 해당하는!
세포생물학을 배웠는데 이걸 모르면 욕먹을만한!
그런 몇 가지 방법들에 대해서만 알아보도록 할게요
사실 이 마저도 하나하나를 깊이있게 알아보려면 너무 많은 배경지식이 필요하기 때문에, 나중에 아예 실험기법들만 따로 모아서 포스트로 작성해보려고 계획하고 있어요. 그러니 본 포스트에서는 느낌 정도만 알아보는 걸로 하죠 ㅋㅋ
1. SDS-PAGE
첫 번째로 알아볼 녀석은 바로 SDS-PAGE에요.
보통 대학에서 생물학 실험 같은 과목을 수강하시게 되면 SDS-PAGE 실험을 한번씩은 다 해보실텐데요!
요 녀석은 간단히 말하자면 단백질 버전 전기영동이예요.
그럼 전기영동이 뭐냐! 하고 물으실 분들도 있으실까봐 설명하자면 ㅋㅋ
전기영동(electrophoresis)는 이름에 ‘전기’가 들어가있는 걸 보면 알 수 있는 것처럼 전기장을 사용해서 특정 물질을 분리해내는 기술이예요.
그림 1 전기영동 모식도
위 그림에 전기영동의 모식도가 나타나 있는데요.
한쪽 끝에 -극을, 나머지 한쪽 끝에 +극을 위치시킨 상태에서 그 사이에 sample을 로딩하고 달리게끔 만드는거예요.
그러면 gel 상에서 얼마나 달렸는지 정도를 가지고 sample 내부의 물질들을 크기에 따라 분리할 수 있어요.
자, 이 때 눈치빠른 분이시라면 알아차렸겠지만, sample 내부의 물질들은 반드시 전하를 띄고 있어야 해요.
전하가 없는 입자라면 양 끝에 아무리 센 전기장을 걸어주더라도 꿈쩍도 하지 않겠죠.
그러면 생체 물질들 중에 전하를 띄고 있는 대표적인 물질들이 뭐가 있을까요?
바로 핵산(DNA, RNA)과 단백질이죠.
그래서 핵산, 단백질을 분리하는데 전기영동이 사용될 수 있는거에요.
그 중 단백질을 분리하는 전기영동법이 SDS-PAGE인 것이죠.
그런데 여기서 SDS-PAGE를 수행하고자 할 때 문제가 있어요.
우리가 기본적으로 단백질 전기영동을 수행하고자 하는 이유는 단백질을 크기에 따라서 분리하기 위해서인데,
단백질마다 가지는 전하도 다 다르기 때문에, 결국 gel 상에서 달릴 떄 크기와 전하가 다 영향을 미치게 되는거죠…
이거 때문에 단백질이 가지고 있는 전하를 공통적으로 통일시켜줄 필요가 있어요.
요런 목적으로 사용되는 두 화합물이 바로 β-mercaptoethanol과 SDS인 거죠.
β-mercaptoethanol은 단백질의 이황화결합을 끊어줘서 단백질을 쭈욱 다 펴주는 녀석이에요.
즉, 구부정하게 접혀있는 단백질을 일직선으로 펴주는 거죠.
β-mercaptoethanol에 의해 단백질이 쭉 펴지게 되면 이 단백질의 표면에 SDS가 coating될 수 있어요.
그런데 이 SDS는 머리부분에 – 전하를 가지고 있어요.
결국 β-mercaptoethanol에 의해 쭉 펴진 단백질 전체가 음전하를 띄는 SDS로 뒤덮이게 되니까 모든 단백질들의 전하가 다 통일될 수 있는거죠.
요런 식으로 단백질들의 전하를 다 통일시켜주고 나면 이제 전처리 과정은 끝난 셈이에요.
그러면 이제 앞서 봤던 전기영동 그림처럼 양쪽에 전기장을 걸어준 상태에서 단백질을 로딩하고 달리게 만드는거죠.
그림 2 SDS-PAGE 결과 예시
그러면 위 그림에 나와있는 것과 같은 결과 data를 얻을 수 있어요.
참고로 SDS-PAGE의 이름은 SDS + PAGE의 합성어인데요.
SDS는 앞에서 단백질의 전하를 통일시키기 위해 사용했던 그 녀석 맞고요.
PAGE는 polyacylamide gel electrophoresis의 약자에요.
이 중 gel electrophoresis는 그냥 전기영동의 뜻이고 polyacyrlamide는 SDS-PAGE 시 주로 사용하는 gel의 한 종류에요.
이런거까지 세세하게 기억하면 머리아프니까! ㅋㅋㅋㅋ
그냥 SDS-PAGE는 단백질의 전하를 다 통일시킨다음에 크기순으로 단백질을 분리하는 방법이구나~~
정도만 기억해두셔도 충분할 것 같아요.
2. 2D gel electrophoresis
다음으로 알아볼 것은 2D gel electrophoresis인데요.
이 녀석도 이름에 electrophoersis(전기영동)이 들어가는 걸 보면 대충 감이 오시지 않으시나요?
이 녀석도 앞서 본 SDS-PAGE와 마찬가지로 전기영동의 일종인데요.
더 엄밀히 말하자면 업그레이드 버전의 SDS-PAGE에요.
앞서 살펴본 SDS-PAGE의 목적이 뭐였죠?
네 단백질을 크기별로 분리하는 거였죠!
이를 위해서 SDS를 이용해서 전하에 의한 차이를 다 상쇄시켜버려줬었죠..
근데 이렇게 SDS-PAGE를 사용하다 보니 크기가 겹치는 단백질들이 너~~~~무 많은 게 문제가 된거죠ㅜㅜ
그래서 단백질을 전하, 크기 두 요소에 대해 다 분리하고자 만들어진 것이 2D gel electrophoresis에요.
아니, 아까 SDS-PAGE에서는 전하 요소를 통일시켜준다고 하지 않았나요?
어떻게 전하, 크기를 둘 다 고려해줄 수 있죠? 그건 걍 SDS 안 쓴 전기영동이랑 다를 게 없지 않나요??
라고 묻는 분이 많으실 것 같은데요.
2D gel electrophoresis에서는 이 문제를 해결하기 위해서 ‘2D’로 전기영동을 수행해줘요.
그림 3 2D gel electrophoresis의 모식도
위 그림에 2D gel electrophoresis의 모식도가 나타나 있어요.
보시면 우선 가로 방향으로 단백질을 전하별로 전기영동해서 분리시켜줘요. (1D gel electrophoresis)
단백질을 전하별로 분리시키기 위해서는 독특한 gel이 사용되는데요.
위 그림 1)에 나타나 있는 것처럼 gel 전반에 걸쳐서 pH가 다 다르게 세팅이 되어있어요.
왜 pH를 다르게 세팅해놓은 걸까요?
그림 4 아미노산
위 그림에는 단백질을 이루고 있는 아미노산의 구조가 나타나 있는데요.
우리가 익숙히 알고 있는 아미노산의 모습은 왼쪽과 같지만,
사실 pH에 따라서 amino group와 carboxyl group은 위 그림 오른쪽과 같이 전하를 가진 채로 존재할 수 있어요.
그리고 위 그림에서는 나타나 있지 않지만 R기의 경우에도 pH에 따라 각기 다른 전하를 가질 수 있어요.
그렇다 보니 단백질의 종류에 따라서 똑같은 pH에서도 서로 다른 전하를 가질 수 있게 되는거죠.
그런데 단백질의 종류에 따라서 각각 자신의 전하가 0이 되는 pH인 isoelectric point가 존재할 수 밖에 없어요.
이걸 이용한게 1D gel electrophoresis인거죠.
그림 5 1D gel electrophoresis 모식도
이제 방금 설명한 내용을 바탕으로 다시 1D gel electrophoresis 모식도를 살펴볼게요.
위 그림과 같이 gel 상에 pH gradient가 쭉 형성되어 있으면
단백질은 각기 다른 isoelectric point 하에서 전하가 0이 되겠죠?
그런데 결국 전하가 0이 되었다는 말은 뭐죠?
아무리 전기장이 강하다 하더라도 전기력을 전혀 받지 않는다는 말이겠죠?
그래서 결국에는 단백질들이 각기 다른 isoelectric point 상에서 멈춰있게 되는거죠.
아무튼 이런 방법을 이용하면 단백질을 전하에 따라서 분리할 수 있어요.
그림 6 2D gel electrophoresis에서의 SDS-PAGE 모식도
그러고 나서 이렇게 분리된 가로 방향으로 긴 gel을 위 그림에 나타난 것처럼 세로축으로 기다란 넓은 gel 맨 위쪽에 착 붙여줘요.
앞서 1D gel electrophoresis를 통해서 이미 단백질을 전하에 따라 분리해줬기 때문에
이 시점에서는 전하에 대한 영향을 고려해줄 필요가 없겠죠?
그래서 앞서와 마찬가지로 SDS를 이용해서 전하를 통일시켜준 상태에서 SDS-PAGE를 이용해 단백질을 크기별로 분리시켜주게 돼요.
내용이 조금 복잡한 것 같아서 다시 정리를 해 볼게요.
1. 1D 방향으로 단백질을 전하에 따라 분리해준다.
2. 이렇게 분리된 1D gel을 SDS-PAGE 시 이용하는 gel에 붙여준다.
3. SDS를 이용해 전하 효과를 없앤 뒤에 단백질을 크기에 따라서 SDS-PAGE로 분리해준다.
이 때 핵심은 단백질을 전하, 크기에 따라서 분리할 수 있다는 거죠.
그림 7 2D gel electrophoresis 결과 예시
위 그림에는 2D gel electrophoresis 결과 예시가 나타나 있으므로 참고하지면 좋을 것 같아요.
3. 그 외…
이번 포스트에서는 SDS-PAGE, 2D electrophoresis에 대해 중점적으로 살펴봤어요.
그렇다고 해서 단백질을 분리, 분석할 수 있는 방법이 이것만 있다고 생각하시면 절대 안된다는 걸 기억해두세요 ㅋㅋㅋ
예를 들어 단백질의 질량을 측정하기 위해서는 질량분석기(mass spectrometry, MS)와 같은 방법이 사용될 수 있고,
단백질의 구조를 결정하기 위해서는 X-ray crystallography, NMR, Cryo-EM과 같은 방법들이 사용될 수 있어요.
이런 기술들에 대해서도 본 포스트에서 설명할 수 있었으면 좋았겠지만,
이 기술들을 제대로 이해하기 위해서는 생물물리학적인 기반지식이 조금은 필요하기 때문에…ㅎㅎ
본 포스트에서는 그렇게 자세히 다루지 않았어요.
이번 포스트에서는 SDS-PAGE, 2D electrophoresis와 같은 단백질의 분석 방법에 대해 알아봤어요.
다음 포스트부터는 세포를 관찰할 때 가장 많이 사용되는 장비 중 하나인 현미경(microscope)에 대해서 알아보도록 할게요!
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생화학 및 생명공학 실험 #8 Protein Expression, SDS-PAGE
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Lac operon을 turn on 상태를 유지하도록 할 수 있다. 발현된 단백질은 soluble proten과 insoluble protein으로 나뉘게 되는데 이것은 toxic한 protein은 cytosol 내에서 lipid layer 등으로 packing이 되기 때문이다. 이 단백질의 N-terminal은 GST, his6, MBP 등으로 tagging을 하기도 하는데, 이것은 후에 binding하는 물질을 이용하여 purify를 용이하게 하기 위함이다. 2) 세포 파쇄 만약 유전공학을 통해 만든 protein을 추출하거나 cell의 순수한 파쇄물을 얻으려면 물리적인 방법으로 세포를 깨야 한다. yeast같은 경우에는 세포를 파쇄하지 않고 세포분비로 가능하나, E.coli는 분비가 불가능하여 세포를 깨어야 한다. 그 방법으로는 다음과 같은 것들이 있으며 이중에 sonication을 실험에 사용하였다. ① vigorous ultrasonication:세포를 suspend buffer에 풀어 놓은 후에 sonicator로 초음파를 용액에다가 쏘면, 그 진동에 의해서 세포막이 깨진다. 이때, 파쇄 중 발생하는 열을 막기 위해 얼음 위에 서 작업한다. 버퍼의 성분과 초음파의 강도를 잘 조절하면, 막만 깨고 다른 내부의 단백질과 같은 내용물의 손상이 없는 상태로 파쇄물을 얻을 수 있다. E.coli에서 가장 많이 사용한다. ② bead milling: Bead로 세포를 갈아서 파쇄시키는 방법. 적은 양의 세포를 파쇄할 때, 사용한다. ③ french press:요즘은 잘 쓰이지 않는다. 조그만 상자에 세포를 풀어놓고 높은 압력으로 누르게 되면 압력에 의해서 세포가 깨지게 된다. 이 방법이 현재 잘 쓰이지 않는 이유는 일단 압력을 주는 기기의 가격이 sonicator에 비해서 2배정도 비싸다. 또 압력을 줄때 쓰는 상자가 압력을 버틸 수 있는 내구성이 있어야 하기 때문에 같은 것만을 사용해야 하는데(전용 상자가 필요함) 이 경우 여러 가지 미생물을 사용할 때 그 상자가 오염될 수 있기 때문이다. 주로 대량의 cell파쇄나 세포벽이 두꺼운 경우 사용하게 된다. ④ enzymatic digestion: enzyme을 이용해 세포벽의 구조를 파괴한다. 효소가 많이 필요한 점, 저효율로 인해 소량 실험시에만 사용한다. 3) SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis 1970년, Laemmli, U.K에 의해 이를 활용한 SDS-PAGE가 개발되었으며, 오늘날 광범위하게 사용되고 있다. 이 방법의 장점은 많은 용적의 시료를 로딩해도 좋은 해상도를 얻을 수 있다는 것이다. Acrylamide를 가교제(cross-linker)로 중합한 polyacrylamide gel은 acrylamide와 가교제의 농도 및 비율에 의해 gel내 미세 통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체분자들을 분리할 수 있을 뿐만 아니라 높은 정밀도와 고 분해능으로 인해 오래 전부터 단백질, 핵산 등의 분리에 널리 사용되어 왔다. SDS 는 ionic detergent 역할을 하여 protein 을 negative charge 로 둘러싼다 . 이것은 protein 간의 전하 차이를 제거하고 , folding 구조를 깨뜨려 모양의 차이도 없앤다 . 그로인해 electrophoresis 를 할 때 순수하게 size 에 해당하는 속도로 migration 되게 해준다 . Running buffer 에 포함된 glycine 은 zwitterion 으로 동시에 음과 양전하를 띌 수 있다 . 따라서 gel 내의 pH 조건에 따라 glycine 의 net charge 가 변하고 이로 인해 전기영동 속도를 조절 할 수 있다 . 먼저 , 전기영동이 시작하게 되면 , Cl- 이온 , 단백질 , glycine 이온이 모두 양극을 향해 출발하게 된다 . Stacking gel 은 단백질들을 일단 일렬로 맞추기 위해서 사용하는 것이다 . Stacking gel 에서는 낮은 pH 조건으로 인해 , glycine 이 거의 중성을 띠게 되므로 국부적인 전류 감소현상이 유발된다 . 따라서 이동도가 빠른 Cl- 와 이동도가 느린 glycine 이온 사이에서 높은 전위차가 발생하게 되고 , 이런 전위차로 인해 glycine 이 Cl- 를 빠르게 뒤쫓게 된다 . 그리고 단백질은 이 둘 사이에서 축적되어 이동되어진다 . Cl- 와 glycine 이온의 간격은 수 mm 로서 많은 용적의 시료에 있던 단백질들도 running gel 에 들어가기 전에 이 사이에 축적되어 해상도를 높이는 효과를 보게 된다 . 그러나 이때에는 stacking gel 이 large-pore gel 이므로 미세통로 크기에 따라 단백질의 molecular sieving 이 일어나지 않는다 . Running gel 에 이르게 되면 , pH 가 높기 때문에 glycine 이 음전하로 강하게 대전되어 glycine 의 이동속도가 가장 빠르게 되고 , 이때 단백질은 molecular sieving 에 의해서 분리가 된다 . Stacking gel 의 pH 는 6.8 정도이고 , running gel 의 pH 는 8.8 정도가 된다 . Ⅲ. Materials & Methods Part 1. protein expression ① 배양액으로부터 세포를 회수하여 그것을 PBS buffer와 섞은 후 vortexing 하였다. => sample ② Ice box에 담은 채로 sonication 시킨다. sonicator를 사용할 때에는 3초 정도 파괴하고 1초 정도 쉬는 형식으로 반복해서 하였다. Sample을 담근 용기와 sonicator 끝 부분의 이상적인 거리는 0.2mm 정도이며 실험 과정에서 나는 소리를 듣고 실험이 잘 되고 있는지를 판별할 수 있다. ③ 어느 정도 시간이 진행되면 sample이 약간 맑아진 것을 확인할 수 있는데, 이 상태가 되면 세포 파쇄가 성공적으로 잘 이루어진 것이다. 만약 거품이 많이 발생되었다면 이는 단백질의 변성에 의한 것이므로 세포막뿐만 아니라 내부의 내용물까지도 손상되었다는 것이다. 이렇게 되지 않도록 초음파의 강도와 buffer의 성분, sample과 sonicator 끝 부분의 거리 등을 주의해서 조절해야 한다. ④ sonication을 거친 suspension 1ml를 100㎕ 따서 tube에 따로 보관해 둔다. => total protein ⑤ 남은 900㎕를 원심분리 한 뒤 상등액을 분리하여 tube에 따로 보관해 둔다. => soluble protein ⑥ 원심분리 후 가라앉은 platelet을 빼서 900㎕의 PBS를 가해 따로 보관해 둔다. => insoluble protein Part 2. SDS-PAGE ① Kit 조립 Gel을 부어넣을 기판, spacer 등 전체를 ethanol 잘 세척해 둔다. 조립 후엔 바닥에 틈새가 새지 않도록 접착제를 붙이며 electrophoresis를 위한 kit에다가 꽂고, 나사로 조인다. 과정 중에서 판이 흐트러지지 않도록 주의한다. 기판이 잘 꽂아졌는지 보기 위해, ehtanol을 부어보아서 새지 않는지 확인하고, 뒤집어서 보관하여 둔다. ② Running gel 제작 H2O 1.6㎖ 30% acrylamid mix 2.0㎖ 1.5M Tris (pH8.8) 1.3㎖ 10% SDS 50㎕ 10% ammonium persulfate 80㎕ TEMED 8㎕ 양이 큰 순서대로 tube에서 제작을 한다. 만드는 도중에 굳거나 거품이 생기지 않도록 조심해야 한다. ③ Running gel setting 피펫을 이용해서 만들어진 gel을 기판 사이에다가 기포가 발생하지 않도록 조심히 부어 넣는다. 그리고 그 위에 70% ethanol 을 더 부어준다. 원래는 프로판올을 사용하는 것으로, 마르지 않기 위한 목적과 골고루 평평하게 굳히기 위해서 사용되어진다. 물보다 비중이 높기 때문에 잘 눌러줄 수 있어 좋다. Gel이 굳어지고, 중합과정이 일어나기 위해 15정도 방치시켜둔다. ④ Staking gel 제작 H2O 1.6㎖ 30% acrylamid mix 2.0㎖ 1.5M Tris (pH8.8) 1.3㎖ 10% SDS 50㎕ 10% ammonium persulfate 80㎕ TEMED 8㎕ 마찬가지로 양이 큰 순서대로 tube에서 제작을 한다. ⑤ Stacking gel setting Running gel이 다 굳었으면, 그 위에 comb를 꽂은 다음 피펫을 이용해서 comb 사이 공간을 통해서 Stacking gel을 기판에다 부어 넣는다. 역시 마찬가지로 기포가 생기지 않도록 조심한다. Gel이 굳어지기 위해 30분정도의 시간을 주도록 한다. Gel이 다 굳어졌으면, comb를 빼어내고, ehtanol을 채운다. ⑥ Loading 하기 size marker를 7㎕ 걸고, 나머지 well에 total, soluble, insoluble 차례로 sample 들을 10㎕씩 loading 한다. gel이 투명하여서 comb로 인해 생긴 공간이 잘 보이지 않기 때문에 특수한 tip을 사용한다. running buffer를 기판 사이와, 기판을 담고 있는 용기에 부어준 다음 전압을 켜고 loading을 시작시켜 1시간 정도 기다린다. (120V를 사용) 기다리면 이미 staining 이 된 marker protein의 색깔이 먼저 내려오므로 이를 통해 진행 상황을 파악할 수 있다. ⑦ Gel staining 시키기 loading이 끝난 gel을 기판에서 떼어내도록 한다. 먼저 buffer를 모두 버린 후, spacer를 빼면서 돌리면 아크릴판과 유리판이 분리된다. 이렇게 하면 gel이 아크릴판에 부착되어 있는 상태를 만들 수 있다. gel이 쉽게 찢어질 수 있기 때문에 이를 조심하여서 떼어내도록 한다. 떼어낸 gel을 페트리 디쉬 안에 넣고, Coomassie Blue가 들어있는 staining 용액을 부어 넣은 후 shaker 위에서 15분간 shaking을 시켜준다. 다시 페트리 디쉬에서 gel만을 꺼내어 낸 다음, 이번에는 destaining 용액을 붓고, shaker 위에서 15분간 shaking을 시켜 준다. 위의 과정을 걸치게 되면, 파란색으로 염색되어 단백질 밴드가 표시되게 된다. Ⅳ. Results 왼쪽부터 size marker, (total protein, soluble protein, insoluble protein) 반복 사진에서 볼 때 가장 왼쪽이 size marker이며 나머지 각각 세 slot이 total, soluble, insoluble의 순서이며 셋 다 protein이 발현되었음을 알 수 있다. cell 내에서는 soluble protein이 insoluble protein 보다 많이 존재하므로, 결과 사진에서 soluble 쪽이 insoluble보다 더 많은 protein이 발현된 것을 확인 할 수 있다. (insoluble이 soluble에 비해 희미하다.) size marker를 통해 본다면 protein의 size가 약 28kDa이라는 것을 알 수 있고, 다른 조원들과도 일치한다. Ⅴ. Discussions 1) 왜 Sonication을 하고 나면 용액이 투명해 질까? 세포파쇄 후에는 세포크기 보다 작은 세포내 기관들이 밖으로 나오게 되고 세포는 사라지게 된다. 그래서 세포보다 크기가 작은 소기관들은 육안으로 구분 할 수 없기 때문에 용액이 투명해 진다. 2) 단백질 발현 균주 선택 방법과 그 차이는? 단백질 발현 균주를 선택할 때는 각 균주가 가지는 장점과 단점을 내가 원하는 유전자의 특징과 비교하여 적절한 균주를 선택하여야 한다. ① Bacteria : cloning vector를 넓은 범위에서 선택할 수 있다. 유전자 발현이 쉽게 조절가능하다. 높은 수득율로 키울 수 있다. secretion을 통해 product를 얻을 수 있다. 하지만 PTM (post translational modification)이 필요한 단백질은 발현 시킬 수 없다. 또, gram negative 박테리아에는 많은 양의 endotoxin이 들어있다. ex) E.coli: Omp와 Lon protease production이 결핍되어 있는 균주, 가장 많이 사용됨 ② Yeast : endotoxin의 양이 적다. PTM이 가능하다. secretion이 가능해서 cell만 down시켜 배지를 농축하여 단백질을 얻을 수 있다. 0.5%정도의 균주의 단백질이 secretion되므로 purification의 효율을 높일 수 있다. mammallian system과 PTM이 동일하지 않다는 단점이 있다. ③ mammalian cell : mammalian expression vector를 사용할 수 있다. PTM이 가능하다. 하지만 사용하는 세포가 거의 다 암세포이고, replication time이 2d~3d정도로 길다. 세포의 성장률도 낮다. 비용이 많이 든다. 즉, 생산율이 많이 떨어진다. 3) 순수한 protein을 얻기 위해서는? 원하는 protein 이외에도 다양한 크기의 잡밴드들을 볼 수 있다. 이는 좀 더 순수한 protein을 얻기 위해서는 좀 더 세심한 정제 과정이 필요하다는 것을 뜻한다. Purificationh을 통해서 protein만 분리하는 실험을 거쳐야 한다. 4) 기타 실험시 주의사항 ① 에탄올로 새지 않는지 확인하는 이유는 만약 새는데 gel을 넣으면 gel이 내려가면서 굳어서 균일해 지지 않게 된다. 따라서 샌다면 다시 앞의 과정을 반복하여야 한다. ② 시료를 넣을 때 TEMED는 마지막에 넣는다. 이 둘은 가교형성 및 가교 형성 촉진하기 때문에 맨 마지막에 넣어야한다. 그렇지 않으면 시료가 tube 내에서 굳어 버린다. 그리고 양이 작기 때문에 넣어지는지 꼭 확인을 해야하며 그렇지 않으면 gel이 굳지 않게 된다.
SDS-PAGE & 2D gel electrophoresis & etc
단세포가 되고파 이번 포스트에서는 정제한 단백질을 분석(analyze)하는 방법에 대해 알아보도록 할게요. 본격적으로 시작하기에 앞서, 단백질을 분석할 수 있는 방법은 엄~~~~~~~~~청 많다는거를 아셔야 해요 ㅋㅋㅋㅋㅋ 그 중에서 아주 기본 중의 기본에 해당하는! 세포생물학을 배웠는데 이걸 모르면 욕먹을만한! 그런 몇 가지 방법들에 대해서만 알아보도록 할게요 사실 이 마저도 하나하나를 깊이있게 알아보려면 너무 많은 배경지식이 필요하기 때문에, 나중에 아예 실험기법들만 따로 모아서 포스트로 작성해보려고 계획하고 있어요. 그러니 본 포스트에서는 느낌 정도만 알아보는 걸로 하죠 ㅋㅋ 1. SDS-PAGE 첫 번째로 알아볼 녀석은 바로 SDS-PAGE에요. 보통 대학에서 생물학 실험 같은 과목을 수강하시게 되면 SDS-PAGE 실험을 한번씩은 다 해보실텐데요! 요 녀석은 간단히 말하자면 단백질 버전 전기영동이예요. 그럼 전기영동이 뭐냐! 하고 물으실 분들도 있으실까봐 설명하자면 ㅋㅋ 전기영동(electrophoresis)는 이름에 ‘전기’가 들어가있는 걸 보면 알 수 있는 것처럼 전기장을 사용해서 특정 물질을 분리해내는 기술이예요. 그림 1 전기영동 모식도 위 그림에 전기영동의 모식도가 나타나 있는데요. 한쪽 끝에 -극을, 나머지 한쪽 끝에 +극을 위치시킨 상태에서 그 사이에 sample을 로딩하고 달리게끔 만드는거예요. 그러면 gel 상에서 얼마나 달렸는지 정도를 가지고 sample 내부의 물질들을 크기에 따라 분리할 수 있어요. 자, 이 때 눈치빠른 분이시라면 알아차렸겠지만, sample 내부의 물질들은 반드시 전하를 띄고 있어야 해요. 전하가 없는 입자라면 양 끝에 아무리 센 전기장을 걸어주더라도 꿈쩍도 하지 않겠죠. 그러면 생체 물질들 중에 전하를 띄고 있는 대표적인 물질들이 뭐가 있을까요? 바로 핵산(DNA, RNA)과 단백질이죠. 그래서 핵산, 단백질을 분리하는데 전기영동이 사용될 수 있는거에요. 그 중 단백질을 분리하는 전기영동법이 SDS-PAGE인 것이죠. 그런데 여기서 SDS-PAGE를 수행하고자 할 때 문제가 있어요. 우리가 기본적으로 단백질 전기영동을 수행하고자 하는 이유는 단백질을 크기에 따라서 분리하기 위해서인데, 단백질마다 가지는 전하도 다 다르기 때문에, 결국 gel 상에서 달릴 떄 크기와 전하가 다 영향을 미치게 되는거죠… 이거 때문에 단백질이 가지고 있는 전하를 공통적으로 통일시켜줄 필요가 있어요. 요런 목적으로 사용되는 두 화합물이 바로 β-mercaptoethanol과 SDS인 거죠. β-mercaptoethanol은 단백질의 이황화결합을 끊어줘서 단백질을 쭈욱 다 펴주는 녀석이에요. 즉, 구부정하게 접혀있는 단백질을 일직선으로 펴주는 거죠. β-mercaptoethanol에 의해 단백질이 쭉 펴지게 되면 이 단백질의 표면에 SDS가 coating될 수 있어요. 그런데 이 SDS는 머리부분에 – 전하를 가지고 있어요. 결국 β-mercaptoethanol에 의해 쭉 펴진 단백질 전체가 음전하를 띄는 SDS로 뒤덮이게 되니까 모든 단백질들의 전하가 다 통일될 수 있는거죠. 요런 식으로 단백질들의 전하를 다 통일시켜주고 나면 이제 전처리 과정은 끝난 셈이에요. 그러면 이제 앞서 봤던 전기영동 그림처럼 양쪽에 전기장을 걸어준 상태에서 단백질을 로딩하고 달리게 만드는거죠. 그림 2 SDS-PAGE 결과 예시 그러면 위 그림에 나와있는 것과 같은 결과 data를 얻을 수 있어요. 참고로 SDS-PAGE의 이름은 SDS + PAGE의 합성어인데요. SDS는 앞에서 단백질의 전하를 통일시키기 위해 사용했던 그 녀석 맞고요. PAGE는 polyacylamide gel electrophoresis의 약자에요. 이 중 gel electrophoresis는 그냥 전기영동의 뜻이고 polyacyrlamide는 SDS-PAGE 시 주로 사용하는 gel의 한 종류에요. 이런거까지 세세하게 기억하면 머리아프니까! ㅋㅋㅋㅋ 그냥 SDS-PAGE는 단백질의 전하를 다 통일시킨다음에 크기순으로 단백질을 분리하는 방법이구나~~ 정도만 기억해두셔도 충분할 것 같아요. 2. 2D gel electrophoresis 다음으로 알아볼 것은 2D gel electrophoresis인데요. 이 녀석도 이름에 electrophoersis(전기영동)이 들어가는 걸 보면 대충 감이 오시지 않으시나요? 이 녀석도 앞서 본 SDS-PAGE와 마찬가지로 전기영동의 일종인데요. 더 엄밀히 말하자면 업그레이드 버전의 SDS-PAGE에요. 앞서 살펴본 SDS-PAGE의 목적이 뭐였죠? 네 단백질을 크기별로 분리하는 거였죠! 이를 위해서 SDS를 이용해서 전하에 의한 차이를 다 상쇄시켜버려줬었죠.. 근데 이렇게 SDS-PAGE를 사용하다 보니 크기가 겹치는 단백질들이 너~~~~무 많은 게 문제가 된거죠ㅜㅜ 그래서 단백질을 전하, 크기 두 요소에 대해 다 분리하고자 만들어진 것이 2D gel electrophoresis에요. 아니, 아까 SDS-PAGE에서는 전하 요소를 통일시켜준다고 하지 않았나요? 어떻게 전하, 크기를 둘 다 고려해줄 수 있죠? 그건 걍 SDS 안 쓴 전기영동이랑 다를 게 없지 않나요?? 라고 묻는 분이 많으실 것 같은데요. 2D gel electrophoresis에서는 이 문제를 해결하기 위해서 ‘2D’로 전기영동을 수행해줘요. 그림 3 2D gel electrophoresis의 모식도 위 그림에 2D gel electrophoresis의 모식도가 나타나 있어요. 보시면 우선 가로 방향으로 단백질을 전하별로 전기영동해서 분리시켜줘요. (1D gel electrophoresis) 단백질을 전하별로 분리시키기 위해서는 독특한 gel이 사용되는데요. 위 그림 1)에 나타나 있는 것처럼 gel 전반에 걸쳐서 pH가 다 다르게 세팅이 되어있어요. 왜 pH를 다르게 세팅해놓은 걸까요? 그림 4 아미노산 위 그림에는 단백질을 이루고 있는 아미노산의 구조가 나타나 있는데요. 우리가 익숙히 알고 있는 아미노산의 모습은 왼쪽과 같지만, 사실 pH에 따라서 amino group와 carboxyl group은 위 그림 오른쪽과 같이 전하를 가진 채로 존재할 수 있어요. 그리고 위 그림에서는 나타나 있지 않지만 R기의 경우에도 pH에 따라 각기 다른 전하를 가질 수 있어요. 그렇다 보니 단백질의 종류에 따라서 똑같은 pH에서도 서로 다른 전하를 가질 수 있게 되는거죠. 그런데 단백질의 종류에 따라서 각각 자신의 전하가 0이 되는 pH인 isoelectric point가 존재할 수 밖에 없어요. 이걸 이용한게 1D gel electrophoresis인거죠. 그림 5 1D gel electrophoresis 모식도 이제 방금 설명한 내용을 바탕으로 다시 1D gel electrophoresis 모식도를 살펴볼게요. 위 그림과 같이 gel 상에 pH gradient가 쭉 형성되어 있으면 단백질은 각기 다른 isoelectric point 하에서 전하가 0이 되겠죠? 그런데 결국 전하가 0이 되었다는 말은 뭐죠? 아무리 전기장이 강하다 하더라도 전기력을 전혀 받지 않는다는 말이겠죠? 그래서 결국에는 단백질들이 각기 다른 isoelectric point 상에서 멈춰있게 되는거죠. 아무튼 이런 방법을 이용하면 단백질을 전하에 따라서 분리할 수 있어요. 그림 6 2D gel electrophoresis에서의 SDS-PAGE 모식도 그러고 나서 이렇게 분리된 가로 방향으로 긴 gel을 위 그림에 나타난 것처럼 세로축으로 기다란 넓은 gel 맨 위쪽에 착 붙여줘요. 앞서 1D gel electrophoresis를 통해서 이미 단백질을 전하에 따라 분리해줬기 때문에 이 시점에서는 전하에 대한 영향을 고려해줄 필요가 없겠죠? 그래서 앞서와 마찬가지로 SDS를 이용해서 전하를 통일시켜준 상태에서 SDS-PAGE를 이용해 단백질을 크기별로 분리시켜주게 돼요. 내용이 조금 복잡한 것 같아서 다시 정리를 해 볼게요. 1. 1D 방향으로 단백질을 전하에 따라 분리해준다. 2. 이렇게 분리된 1D gel을 SDS-PAGE 시 이용하는 gel에 붙여준다. 3. SDS를 이용해 전하 효과를 없앤 뒤에 단백질을 크기에 따라서 SDS-PAGE로 분리해준다. 이 때 핵심은 단백질을 전하, 크기에 따라서 분리할 수 있다는 거죠. 그림 7 2D gel electrophoresis 결과 예시 위 그림에는 2D gel electrophoresis 결과 예시가 나타나 있으므로 참고하지면 좋을 것 같아요. 3. 그 외… 이번 포스트에서는 SDS-PAGE, 2D electrophoresis에 대해 중점적으로 살펴봤어요. 그렇다고 해서 단백질을 분리, 분석할 수 있는 방법이 이것만 있다고 생각하시면 절대 안된다는 걸 기억해두세요 ㅋㅋㅋ 예를 들어 단백질의 질량을 측정하기 위해서는 질량분석기(mass spectrometry, MS)와 같은 방법이 사용될 수 있고, 단백질의 구조를 결정하기 위해서는 X-ray crystallography, NMR, Cryo-EM과 같은 방법들이 사용될 수 있어요. 이런 기술들에 대해서도 본 포스트에서 설명할 수 있었으면 좋았겠지만, 이 기술들을 제대로 이해하기 위해서는 생물물리학적인 기반지식이 조금은 필요하기 때문에…ㅎㅎ 본 포스트에서는 그렇게 자세히 다루지 않았어요. 이번 포스트에서는 SDS-PAGE, 2D electrophoresis와 같은 단백질의 분석 방법에 대해 알아봤어요. 다음 포스트부터는 세포를 관찰할 때 가장 많이 사용되는 장비 중 하나인 현미경(microscope)에 대해서 알아보도록 할게요!
다인바이오
SDS-PAGE (주)다인바이오 연구소 1. SDS-PAGE • SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)는 생화학과 유전학 및 분자생물학 등에 이용되는 단백질 분리 기술로, 그들의 전기 영동 이동성(polypeptide chain의 길이 또는 분자량 뿐만 아니라 protein folding, posttranslational modification과 다른 인자들에 의한)을 이용한 기술이다. • SDS는 S odium D odecyl S ulfate(C 12 H 25 NaO 4 S, MW: 288.38)의 약어로 음이온성 계면활성제의 일종으로 native protein을 individual polypeptides로 denature하는 데에 가장 자주 사용되는 agent이다. SDS는 단백질에 이온적 결합하는 다른 micelle을 형성하는 경우도 있어 그 결합량은 polypeptide 사슬(단백질) 1에 대하여 1.2~1.5로 알려져 있다. 단백질은 구성하는 아미노산에 의해서 (+), (-) 상관없이 어느 쪽이건 전하를 띄지만 SDS가 결합(SDS 처리)함으로써 일시적으로 (-)하전을 띄어 모든 분자를 양극으로 이동시키고, gel의 pore 사이즈에 의해서 분자량의 크기에 따라 각각의 단백질을 분리할 수 있다. 이 단백질들의 이동성은 분자량에 대수적으로 선형인 함수 관계를 가진다. 2. Polyacrylamide gel의 종류 • 단백질의 polyacrylamide gel 전기영동에는 다양한 종류가 있다. 형태로 구분하면 Disk형, lab(수직)형, 수평형 등이 있는데 전기영동에 따라 구분해서 사용한다. 방법에서는 분자량 사이즈로 나누는 SDS polyacrylamide gel 전기영동(SDS-PAGE), 등전점으로 나누는 등전점 전기영동(IEF), 2가지 원리(예를 들어 상기의 분자량 사이즈와 등전점)를 2차원으로 전개하는 2차원 전기영동 등이 있다. 3. SDS-PAGE에서 단백질이 분리되는 원리 • 처음 단백질 solution은 음이온화 detergent인 SDS가 첨가된 후에 2차 구조와 non-disulfide bond에 의한 4차 구조가 denature된다. 또한 단백질의 질량에 따라 일정 비율로 각 단백질이 (-) charge를 띄게 된다. SDS가 없이는 분자량이 비슷한 다른 단백질들이 protein folding의 차이로 인해서 다르게 이동하는데, folding 방식의 차이에 따라 어떤 단백질들은 gel에서 다른 단백질보다 더 빠르게 이동할 수 있다. SDS를 첨가함으로 이러한 문제점들을 해결하고 선형으로 단백질을 만들어 분자량(1차 구조 또는 아미노산 수)의 크기에 따라 분리할 수 있게 된다. • SDS가 단백질에 결합하는 비율은 대략 1.4g SDS에 1.0g 단백질이다. 이 비율은 대략 전체 질량에 비례한다. 대부분 단백질은 이에 따라 오직 단백질의 size만 gel 내 이동거리와 관련되어 gel 속을 움직이게 된다. Tracking dye가 단백질 solution에 첨가되어 전기영동 시에 단백질의 이동을 구분할 수 있게 된다. Denature된 단백질은 전류가 gel을 통해 흐르면 (-) charge의 단백질이 anode(+)로 이동하게 된다. Size에 따라서 각 단백질은 다르게 gel을 통과하며 작은 단백질은 쉽게 gel의 pore를 통과하고 더 멀리 이동하게 된다. 따라서 정해진 얼마의 시간(전압의 크기에 따라 해상도가 다르며, 수 시간이 소요될 수 있다)이 지나면 size 별로 이동성이 다르게 분리되어 있다. 큰 단백질은 시작점에 가까운데 반해 작은 단백질은 더 많이 이동하게 된다. 후에 Coomassie Briliant Blue나 silver stain으로 염색한다. Marker 단백질을 사용하여 각 단백질들의 크기를 측정할 수 있다. 4. 시료 • 단백질 SDS-PAGE에서는 SDS가 가용화제로 작용하기 때문에 우선 SDS를 처리하여 침전물이 있으면 원심분리로 이를 제거한다. SDS는 SDS 용액(시료 처리액)과 혼합시킨 후 2~3분간 가열하는 것이 일반적이지만, 열을 가하지 않고 실온에서 하룻밤 방치하는 방법도 있다. 시료에 따라 적합한 방법을 검토하기 바란다. 시료의 보존방법은 SDS 처리 전후에 상관없이 일반적으로 냉동 보존하지만 반복적인 융해는 바람직하지 않다. 5. Buffer • 단백질 polyacrylamide gel 전기영동에서는 Phosphate buffer나 Tris buffer가 많이 사용된다. SDS-PAGE의 Weber-Osborn법은 Phosphate buffer, Laemmli법에서는 Tris buffer계열이 사용되므로 모두 알칼리성 조건이다. Laemmli법은 gel에 Tris-HCl을, 전기영동용 buffer로 Tris-Glycine을 사용하여 Cl-과 glycinate 이온의 이동도의 차이를 이용하여 시료를 농축하고 있어 샤프한 밴드를 얻을 수 있는 장점이 있다. 따라서 전기영동용 buffer에 pH를 맞추려고 HCl을 첨가하거나 일단 사용한 전기영동용 buffer을 다시 사용하면 이온계에 이상이 발생하여 전기영동결과에 영향을 주는 경우가 있기 때문에 피하는 것이 좋다. 또 조제나 희석할 경우 농도를 잘못 맞추면 전기영동 패턴이 흐트러지거나 전기영동시간이 매우 길어질 수 있다. 6. Stacking gel과 running(resolving) gel의 역할 • 불연속 buffer system은 이온 농도차를 만들어 전기영동의 1차 단계에서 모든 단백질이 하나의 예리한 band를 만들게 해준다. 이것은 큰 pore를 갖고 있는 gel matrix가 focusing 또는 stacking gel에서 단백질 이동을 방해하지 않기 때문이다. (-) ion이 stack 되어 있는 단백질들을 넘어서 1차 buffer를 넘어가면, 이온 농도차가 사라지고 단백질들은 일제히 resolving 구간으로 넘어가서 단백질 분리가 시작된다. • Stacking gel – Large pore의 polyacrylamide gel(4%)이다. Tris buffer는 pH 6.8을 사용하며 전기영동 buffer보다 2 pH unit이 적은 값을 사용한다. 이 환경은 Kohlrausch reaction을 제공한다. 결과적으로 단백질은 몇 겹으로 뭉치게 되어 Starting zone에 19um 정도로 수분간 쌓이게 된다. 이 gel은 resolving gel을 감싸게 된다. Stacking gel 부분은 언제나 sample의 높이와 양보다 두 배 이상 많아야 한다. • Friedrich Kohlrausch reaction – 움직이는 이온의 각각 타입은 특정한 전기 저항성에 의한 것이며, 원래의 분자 조합이 어떤 것인가는 관련이 없다. 따라서 주어진 물질에 관한 이온 이동은 오직 solution의 전기 저항에 영향을 받는다. SDS-PAGE의 경우에는 단백질 역시 크기에 상관 없이 stacking gel에서 동일하게 움직이게 되며, 이용되는 buffer들 간의 이온 이동속도는 pH 조건을 사용하여 조절할 수 있다. • Running(resolving) gel – 작은 pore의 polyacrylamide gel(3~30%)이다. Tris buffer는 pH 8.8을 사용한다. 고분자는 이 gel 안에서 size대로 분리된다. 현재 실험에서 8% gel은 24-205kDa, 10% gel은 14-205kDa, 12% gel은 14-66kDa 단백질을 분리하는데 주로 사용된다. 7. 검출 • 전기영동된 시료는 눈에 보이지 않기 때문에 전기영동 후에는 신속하게 검출 해야 한다. 단백질은 일반적으로 CBB(Commassie Brilliant Blue)로 염색한다. Dye염색은 용액 속에 gel을 담궈두기만 해도 되므로 간단하고 저렴한 방법으로, CBB는 수백 ng을 검출할 정도로 감도가 높다. 이 밖에도 dye를 이용하여 염색할 때는 Amido Black 10B라는 감도는 다소 뒤떨어지지만 단백질의 검출에 좋은 것도 있다. 이들은 모두 acetic acid·methanol이 있을 때 염색과 탈색이 이루어 지며, 단백질을 고정시킬 수도 있다. 최근에는 형광 색소도 이용되고 있으나 이는 별도의 검출장치가 필요하다. Negative 법이란 백그라운드(gel)가 흰색으로 단백질(밴드)이 투명하게 남기 때문에 이와 같이 불리고 있다. 또한 더욱 높은 감도의 검출법으로 silver stain이 이용되고 있다. CBB의 약 100배 정도의 감도로 수 ng의 검출도 가능하다. 염색법과 비교하면 조작 과정이 복잡하고, 재현성이 다소 떨어지는 등의 문제도 있지만, 많은 회사에서 다양한 제품이 출시되어 사용하기 편리해졌다. 검출법 반응 구체적 예 조작성 감도 색소염색 유색 색소의 단백질 결합 형광 색소의 단백질 결합 CBB(Commassie Brilliant Blue) Amido Black10B Sypro Orange ◎ ◎ △ ○ △ ○ Nagative 법 SDS와 양이온의 혼합 Zu, K, Ca 등 *백그라운드가 흰색 ○ ○ Silver stain 은의 침착 Silver stain △ ◎ 표식법 단백질 표식물의 검출 RI, 형광색소 × ◎~◎ 8. 해석 ∙ 보존 • 얻어진 전기영동 결과로 목적에 맞게 해석한다. 예를 들어 어떤 단백질의 분자량을 측정하고자 할 때, 이미 알고 있는 분자량 단백질(분자량 마커)의 이동도를 측정하여 검량선을 제작하고 이것을 이용하여 분자량을 측정한다. 또 시료를 비교하는 경우에는 밴드의 유무나 농도를 살펴본다. 데이터는 사진으로 촬영하거나 gel 그 자체를 건조시켜 보관하는 방법 등이 있다. 최근에는 CCD 카메라로 촬영하고 컴퓨터에 저장하여 전용 소프트웨어로 해석하는 방법이 널리 이용되고 있다. 이와 같은 기기를 사용하면 해석
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생화학 및 생명공학 실험 #8 Protein Expression, SDS-PAGE
BiS324 Biochemistry and Biotechnology Experiment
< Laboratory #8 >
Protein Expression
SDS-PAGE
Ⅰ. Objectives
단백질 발현에 대해 전반적인 지식을 쌓는다.
세포 내 단백질 발현을 유도한 뒤 파쇄 하여 단백질을 추출해 내고, SDS-PAGE를 통해 단백질 발현 유무를 확인한다.
Ⅱ. Introduction
1) IPTG induction
Bacteria를 transformation하여 protein을 발현시키면 여러 가지 이점이 있다. ① 많은 증식으로 원하는 실험을 자유롭게 할 수 있다. ② 다양한 vector를 선택 가능하다. ③ Operon을 통하여 gene expression 조절이 쉽다. 이 가운데 cell을 배양해서 삽입한 gene이 발현되도록 하여 protein을 얻는 과정을 induction이라고 한다.
실험에 사용한 vector gene은 lac operon의 산물인 T7 polymerase에 의해 turn on이 되도록 구성되어 있다. Lac operon의 경우 promoter다음에 operator위치에 평소에는 repressor가 결합하고 있는 상태이다. 이 때 lactose를 넣어주면 repressor와 결합하여 lac operon유전자로부터 떼어내게 되고 이어 단백질 합성이 일어난다. 따라서 삽입한 vector gene이 발현되도록 하기 위해서는 lactose를 공급해야한다. 하지만 lac operon에 의해 발현되는 protein은 lactose를 분해하는 enzyme이 있어서 문제가 된다.
Lactose와 비슷한 구조를 가지고 같은 기능을 보이는 화합물 중 대표적인 것이 바로 IPTG (lactose의 analog이자 agonist) 이다. 인공적인 화합물인 IPTG는 경우 세포내에서 분해가 되지 않아서 항상 같은 양의 발현을 유도할 수 있기 때문에 실험에서 inducer로 자주 사용된다. Lac operon을 turn on 상태를 유지하도록 할 수 있다.
발현된 단백질은 soluble proten과 insoluble protein으로 나뉘게 되는데 이것은 toxic한 protein은 cytosol 내에서 lipid layer 등으로 packing이 되기 때문이다. 이 단백질의 N-terminal은 GST, his6, MBP 등으로 tagging을 하기도 하는데, 이것은 후에 binding하는 물질을 이용하여 purify를 용이하게 하기 위함이다.
2) 세포 파쇄
만약 유전공학을 통해 만든 protein을 추출하거나 cell의 순수한 파쇄물을 얻으려면 물리적인 방법으로 세포를 깨야 한다. yeast같은 경우에는 세포를 파쇄하지 않고 세포분비로 가능하나, E.coli는 분비가 불가능하여 세포를 깨어야 한다. 그 방법으로는 다음과 같은 것들이 있으며 이중에 sonication을 실험에 사용하였다.
① vigorous ultrasonication:세포를 suspend buffer에 풀어 놓은 후에 sonicator로 초음파를 용액에다가 쏘면, 그 진동에 의해서 세포막이 깨진다. 이때, 파쇄 중 발생하는 열을 막기 위해 얼음 위에 서 작업한다. 버퍼의 성분과 초음파의 강도를 잘 조절하면, 막만 깨고 다른 내부의 단백질과 같은 내용물의 손상이 없는 상태로 파쇄물을 얻을 수 있다. E.coli에서 가장 많이 사용한다.
② bead milling: Bead로 세포를 갈아서 파쇄시키는 방법. 적은 양의 세포를 파쇄할 때, 사용한다.
③ french press:요즘은 잘 쓰이지 않는다. 조그만 상자에 세포를 풀어놓고 높은 압력으로 누르게 되면 압력에 의해서 세포가 깨지게 된다. 이 방법이 현재 잘 쓰이지 않는 이유는 일단 압력을 주는 기기의 가격이 sonicator에 비해서 2배정도 비싸다. 또 압력을 줄때 쓰는 상자가 압력을 버틸 수 있는 내구성이 있어야 하기 때문에 같은 것만을 사용해야 하는데(전용 상자가 필요함) 이 경우 여러 가지 미생물을 사용할 때 그 상자가 오염될 수 있기 때문이다. 주로 대량의 cell파쇄나 세포벽이 두꺼운 경우 사용하게 된다.
④ enzymatic digestion: enzyme을 이용해 세포벽의 구조를 파괴한다. 효소가 많이 필요한 점, 저효율로 인해 소량 실험시에만 사용한다.
3) SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
1970년, Laemmli, U.K에 의해 이를 활용한 SDS-PAGE가 개발되었으며, 오늘날 광범위하게 사용되고 있다. 이 방법의 장점은 많은 용적의 시료를 로딩해도 좋은 해상도를 얻을 수 있다는 것이다. Acrylamide를 가교제(cross-linker)로 중합한 polyacrylamide gel은 acrylamide와 가교제의 농도 및 비율에 의해 gel내 미세 통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체분자들을 분리할 수 있을 뿐만 아니라 높은 정밀도와 고 분해능으로 인해 오래 전부터 단백질, 핵산 등의 분리에 널리 사용되어 왔다.
SDS 는 ionic detergent 역할을 하여 protein 을 negative charge 로 둘러싼다 . 이것은 protein 간의 전하 차이를 제거하고 , folding 구조를 깨뜨려 모양의 차이도 없앤다 . 그로인해 electrophoresis 를 할 때 순수하게 size 에 해당하는 속도로 migration 되게 해준다 .
Running buffer 에 포함된 glycine 은 zwitterion 으로 동시에 음과 양전하를 띌 수 있다 . 따라서 gel 내의 pH 조건에 따라 glycine 의 net charge 가 변하고 이로 인해 전기영동 속도를 조절 할 수 있다 . 먼저 , 전기영동이 시작하게 되면 , Cl- 이온 , 단백질 , glycine 이온이 모두 양극을 향해 출발하게 된다 .
Stacking gel 은 단백질들을 일단 일렬로 맞추기 위해서 사용하는 것이다 . Stacking gel 에서는 낮은 pH 조건으로 인해 , glycine 이 거의 중성을 띠게 되므로 국부적인 전류 감소현상이 유발된다 . 따라서 이동도가 빠른 Cl- 와 이동도가 느린 glycine 이온 사이에서 높은 전위차가 발생하게 되고 , 이런 전위차로 인해 glycine 이 Cl- 를 빠르게 뒤쫓게 된다 . 그리고 단백질은 이 둘 사이에서 축적되어 이동되어진다 . Cl- 와 glycine 이온의 간격은 수 mm 로서 많은 용적의 시료에 있던 단백질들도 running gel 에 들어가기 전에 이 사이에 축적되어 해상도를 높이는 효과를 보게 된다 . 그러나 이때에는 stacking gel 이 large-pore gel 이므로 미세통로 크기에 따라 단백질의 molecular sieving 이 일어나지 않는다 .
Running gel 에 이르게 되면 , pH 가 높기 때문에 glycine 이 음전하로 강하게 대전되어 glycine 의 이동속도가 가장 빠르게 되고 , 이때 단백질은 molecular sieving 에 의해서 분리가 된다 .
Stacking gel 의 pH 는 6.8 정도이고 , running gel 의 pH 는 8.8 정도가 된다 .
Ⅲ. Materials & Methods
Part 1. protein expression
① 배양액으로부터 세포를 회수하여 그것을 PBS buffer와 섞은 후 vortexing 하였다.
=> sample
② Ice box에 담은 채로 sonication 시킨다. sonicator를 사용할 때에는 3초 정도 파괴하고 1초 정도 쉬는 형식으로 반복해서 하였다. Sample을 담근 용기와 sonicator 끝 부분의 이상적인 거리는 0.2mm 정도이며 실험 과정에서 나는 소리를 듣고 실험이 잘 되고 있는지를 판별할 수 있다.
③ 어느 정도 시간이 진행되면 sample이 약간 맑아진 것을 확인할 수 있는데, 이 상태가 되면 세포 파쇄가 성공적으로 잘 이루어진 것이다. 만약 거품이 많이 발생되었다면 이는 단백질의 변성에 의한 것이므로 세포막뿐만 아니라 내부의 내용물까지도 손상되었다는 것이다. 이렇게 되지 않도록 초음파의 강도와 buffer의 성분, sample과 sonicator 끝 부분의 거리 등을 주의해서 조절해야 한다.
④ sonication을 거친 suspension 1ml를 100㎕ 따서 tube에 따로 보관해 둔다.
=> total protein
⑤ 남은 900㎕를 원심분리 한 뒤 상등액을 분리하여 tube에 따로 보관해 둔다.
=> soluble protein
⑥ 원심분리 후 가라앉은 platelet을 빼서 900㎕의 PBS를 가해 따로 보관해 둔다.
=> insoluble protein
Part 2. SDS-PAGE
① Kit 조립
Gel을 부어넣을 기판, spacer 등 전체를 ethanol 잘 세척해 둔다. 조립 후엔 바닥에 틈새가 새지 않도록 접착제를 붙이며 electrophoresis를 위한 kit에다가 꽂고, 나사로 조인다. 과정 중에서 판이 흐트러지지 않도록 주의한다. 기판이 잘 꽂아졌는지 보기 위해, ehtanol을 부어보아서 새지 않는지 확인하고, 뒤집어서 보관하여 둔다.
② Running gel 제작
H2O 1.6㎖ 30% acrylamid mix 2.0㎖ 1.5M Tris (pH8.8) 1.3㎖ 10% SDS 50㎕ 10% ammonium persulfate 80㎕ TEMED 8㎕
양이 큰 순서대로 tube에서 제작을 한다. 만드는 도중에 굳거나 거품이 생기지 않도록 조심해야 한다.
③ Running gel setting
피펫을 이용해서 만들어진 gel을 기판 사이에다가 기포가 발생하지 않도록 조심히 부어 넣는다. 그리고 그 위에 70% ethanol 을 더 부어준다. 원래는 프로판올을 사용하는 것으로, 마르지 않기 위한 목적과 골고루 평평하게 굳히기 위해서 사용되어진다. 물보다 비중이 높기 때문에 잘 눌러줄 수 있어 좋다. Gel이 굳어지고, 중합과정이 일어나기 위해 15정도 방치시켜둔다.
④ Staking gel 제작
H2O 1.6㎖ 30% acrylamid mix 2.0㎖ 1.5M Tris (pH8.8) 1.3㎖ 10% SDS 50㎕ 10% ammonium persulfate 80㎕ TEMED 8㎕
마찬가지로 양이 큰 순서대로 tube에서 제작을 한다.
⑤ Stacking gel setting
Running gel이 다 굳었으면, 그 위에 comb를 꽂은 다음 피펫을 이용해서 comb 사이 공간을 통해서 Stacking gel을 기판에다 부어 넣는다. 역시 마찬가지로 기포가 생기지 않도록 조심한다. Gel이 굳어지기 위해 30분정도의 시간을 주도록 한다. Gel이 다 굳어졌으면, comb를 빼어내고, ehtanol을 채운다.
⑥ Loading 하기
size marker를 7㎕ 걸고, 나머지 well에 total, soluble, insoluble 차례로 sample 들을 10㎕씩 loading 한다. gel이 투명하여서 comb로 인해 생긴 공간이 잘 보이지 않기 때문에 특수한 tip을 사용한다.
running buffer를 기판 사이와, 기판을 담고 있는 용기에 부어준 다음 전압을 켜고 loading을 시작시켜 1시간 정도 기다린다. (120V를 사용) 기다리면 이미 staining 이 된 marker protein의 색깔이 먼저 내려오므로 이를 통해 진행 상황을 파악할 수 있다.
⑦ Gel staining 시키기
loading이 끝난 gel을 기판에서 떼어내도록 한다. 먼저 buffer를 모두 버린 후, spacer를 빼면서 돌리면 아크릴판과 유리판이 분리된다. 이렇게 하면 gel이 아크릴판에 부착되어 있는 상태를 만들 수 있다. gel이 쉽게 찢어질 수 있기 때문에 이를 조심하여서 떼어내도록 한다.
떼어낸 gel을 페트리 디쉬 안에 넣고, Coomassie Blue가 들어있는 staining 용액을 부어 넣은 후 shaker 위에서 15분간 shaking을 시켜준다. 다시 페트리 디쉬에서 gel만을 꺼내어 낸 다음, 이번에는 destaining 용액을 붓고, shaker 위에서 15분간 shaking을 시켜 준다.
위의 과정을 걸치게 되면, 파란색으로 염색되어 단백질 밴드가 표시되게 된다.
Ⅳ. Results
왼쪽부터 size marker, (total protein, soluble protein, insoluble protein) 반복
사진에서 볼 때 가장 왼쪽이 size marker이며 나머지 각각 세 slot이 total, soluble, insoluble의 순서이며 셋 다 protein이 발현되었음을 알 수 있다. cell 내에서는 soluble protein이 insoluble protein 보다 많이 존재하므로, 결과 사진에서 soluble 쪽이 insoluble보다 더 많은 protein이 발현된 것을 확인 할 수 있다. (insoluble이 soluble에 비해 희미하다.)
size marker를 통해 본다면 protein의 size가 약 28kDa이라는 것을 알 수 있고, 다른 조원들과도 일치한다.
Ⅴ. Discussions
1) 왜 Sonication을 하고 나면 용액이 투명해 질까?
세포파쇄 후에는 세포크기 보다 작은 세포내 기관들이 밖으로 나오게 되고 세포는 사라지게 된다. 그래서 세포보다 크기가 작은 소기관들은 육안으로 구분 할 수 없기 때문에 용액이 투명해 진다.
2) 단백질 발현 균주 선택 방법과 그 차이는?
단백질 발현 균주를 선택할 때는 각 균주가 가지는 장점과 단점을 내가 원하는 유전자의 특징과 비교하여 적절한 균주를 선택하여야 한다.
① Bacteria
: cloning vector를 넓은 범위에서 선택할 수 있다. 유전자 발현이 쉽게 조절가능하다. 높은 수득율로 키울 수 있다. secretion을 통해 product를 얻을 수 있다. 하지만 PTM (post translational modification)이 필요한 단백질은 발현 시킬 수 없다. 또, gram negative 박테리아에는 많은 양의 endotoxin이 들어있다.
ex) E.coli: Omp와 Lon protease production이 결핍되어 있는 균주, 가장 많이 사용됨
② Yeast
: endotoxin의 양이 적다. PTM이 가능하다. secretion이 가능해서 cell만 down시켜 배지를 농축하여 단백질을 얻을 수 있다. 0.5%정도의 균주의 단백질이 secretion되므로 purification의 효율을 높일 수 있다. mammallian system과 PTM이 동일하지 않다는 단점이 있다.
③ mammalian cell
: mammalian expression vector를 사용할 수 있다. PTM이 가능하다. 하지만 사용하는 세포가 거의 다 암세포이고, replication time이 2d~3d정도로 길다. 세포의 성장률도 낮다. 비용이 많이 든다. 즉, 생산율이 많이 떨어진다.
3) 순수한 protein을 얻기 위해서는?
원하는 protein 이외에도 다양한 크기의 잡밴드들을 볼 수 있다. 이는 좀 더 순수한 protein을 얻기 위해서는 좀 더 세심한 정제 과정이 필요하다는 것을 뜻한다. Purificationh을 통해서 protein만 분리하는 실험을 거쳐야 한다.
4) 기타 실험시 주의사항
① 에탄올로 새지 않는지 확인하는 이유는 만약 새는데 gel을 넣으면 gel이 내려가면서 굳어서 균일해 지지 않게 된다. 따라서 샌다면 다시 앞의 과정을 반복하여야 한다.
② 시료를 넣을 때 TEMED는 마지막에 넣는다. 이 둘은 가교형성 및 가교 형성 촉진하기 때문에 맨 마지막에 넣어야한다. 그렇지 않으면 시료가 tube 내에서 굳어 버린다. 그리고 양이 작기 때문에 넣어지는지 꼭 확인을 해야하며 그렇지 않으면 gel이 굳지 않게 된다.
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