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제작 울산청소년과학탐구연구회
지원 한국과학창의재단
강사 김학표, 김태영 선생님
세균을 염색약으로 분류할 수 있다?!
그람 염색으로 염색이 되면 그람 양성균, 염색이 되지 않으면 그람 음성균이라고 한다. 그람 염색법의 과정을 하나하나 체험해보는 시간을 가진다.
이 프로그램은 과학기술진흥기금 및 복권기금으로 수행된 성과물로서 우리나라 과학기술발전과 사회적 가치증진에 기여하고 있습니다.
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그람염색을 통한 세균관찰 – 제품실험자료 – (주)생물나라
⑵ 그람 염색법을 사용하여 배양한 세균이 그람양성 세균인지 그람음성 세균인지를 구별할 수 있다. Ⅲ. 실험재료. 현미경, 슬라이드글라스, …
Source: www.biozoa.co.kr
Date Published: 10/11/2021
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Gram staining실험 방법에대해 자세히 알려주세요. > BRIC
대학에서 보통 그람 양성균은 보통 황색포도상구균, 그람음성으론 대장균으로 실험 많이 합니다. 실험방법은 아래와 같습니다. □ 그람염색의 원리.
Source: www.ibric.org
Date Published: 12/19/2022
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7. 그람 염색(Gram staining)
본 실험에서는 염색과정에 따른 그람 양성균 및 음성균의 색변화를 관찰 한 후 그람. 양성 세균 및 음성 세균을 판정한다. 3. 준비물. ⦁미생물 순수 배양액(2종). ⦁광학 …
Source: www.sangji.ac.kr
Date Published: 3/26/2021
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그람 염색 – 위키백과, 우리 모두의 백과사전
그람 염색법(Gram staining, – 染色)은 1884년 덴마크의 의사인 한스 크리스티안 그람이 고안한 특수 염색법으로 세균류를 염색하기 위해 사용한다.
Source: ko.wikipedia.org
Date Published: 8/19/2022
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그람염색 (Gram stain)
미생물의 이해 – 그람 염색 (Gram stain). 실험 목적. 세균의 동정, 분류의 중요한 지표인 그람 양성균과 그람 음성균을 구분하고 동시에 분별염색의 원리와 조작법을 …
Source: wz3.jbnu.ac.kr
Date Published: 3/28/2022
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그람염색 – 대한진단검사의학회
그람염색은 감염이 의심되는 부위에서 채취한 검체에서 미생물, 특히 세균의 존재를 검출하기 위한 검사실 방법입니다.
Source: labtestsonline.kr
Date Published: 6/22/2021
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그람 염색(Gram staining) 방법 – 생물닷컴
그람염색은 세균학에서 가장 많이 사용되고 있는 염색법이다. 그람양성균과 그람음성균을 구별하는 염색이기 때문에 … 실험 재료, 시약 및 기구.
Source: biolabkorea.com
Date Published: 11/28/2021
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주제에 대한 기사 평가 그람 염색 실험
- Author: 전국과학교사협회 (전과협)
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- Date Published: 2021. 11. 27.
- Video Url link: https://www.youtube.com/watch?v=7o4yat4WlPo
그람염색을 통한 세균관찰
Ⅰ. 서론
세균은 크기가 매우 작기 때문에 많은 개체가 모여 군체를 형성한다. 그리고 광학 현미경으로 개체의 특성을 관찰하려면 특수한 염색이 필요하다. 그람양성 세균은 크리스탈 바이올렛 등의 염기성 염료로 염색되어 탈색제 처리 후에도 탈색되지 않고 보라색을 나타내는 세균이다. 그람음성 세균은 탈색제에 의해 크리스탈바이올렛이 탈색되고 대응 염색제에 의해 염색되어 붉은색을 나타내는 세균이다. 우리 주변에서 배양한 세균이 어떤 세균인지 그람 염색법을 통해 확인해 보자.
Ⅱ. 실험목표
⑴ 세균을 염색하여 그 모습을 관찰할 수 있다.
⑵ 그람 염색법을 사용하여 배양한 세균이 그람양성 세균인지 그람음성 세균인지를 구별할 수 있다.
Ⅲ. 실험재료
현미경, 슬라이드글라스, 커버글라스, 루프, 분젠버너, 스포이트, 거름종이, 시험관 집게, 성냥, 배양된 세균, 증류수, Crystal violet 용액 , Gram’s Iodine 용액, 탈색제(아세톤-에탄올), 샤프라닌염색액
Ⅳ. 실험과정
① 슬라이드 글라스를 알콜로 깨끗이 닦아 지방을 제거한다.
② 슬라이드 글라스 위에 멸균 생리식염수 한 방울을 떨어뜨린다.
③ 한천 배지에서 18-24 시간 배양한 균을 백금이로 소량 따서 슬라이드 글라스 위의 생리 식염수에 잘 푼다.
④ 공기 중에서 건조시킨다.
⑤ 알콜 램프 위를 3-4회 통과시키면서 불꽃에서 건조 고정한다.
⑥ Crystal violet 염색약으로 염색한다. 약 1분간 방치한다.
⑦ 슬라이드 뒷면으로 수돗물을 흐르게 하여 조금씩 씻는다. iodine 용액을 충분히 가하고 약 1분간 반응시킨다.
⑧ 탈색제로 에탄올을 사용하여 충분히 탈색시킨 다음 흐르는 물로 탈색제를 씻어낸다.
⑨ 대조 염색으로 safranin O 용액을 가하고 약 30초간 염색한다.
⑩ 흐르는 물로 염색액을 씻어내고 건조시킨 다음 현미경으로 그람염색성을 관찰한다.
Ⅴ. 실험결과 및 토의
⑴ 결과 및 분석
① 그람양성균은 그람염색법에 의하여 자주색(보라색에 가까운 파란색)으로 나타난다.
② 그람음성균은 그람염색법에 의하여 자주색은 탈색되고 사프라닌으로 붉게 염색된다.
⑵ 토의
① 그람염색법에 의해 관찰한 결과를 그림으로 그려보자.
② 현미경으로 관찰한 세균은 그람양성인가 아니면 음성인가?
③ 그람염색법에서 에탄올에 의해 탈색되는 세균은 어느 것인가?
④ 세균 염색법의 종류와 방법 및 원리에 대해 조사해보자.
⑤ 그람양성균과 음성균의 차이점에 대해 조사해보자.
Ⅵ. 참고자료
⑴ 그람염색의 원리
그람양성균은 염색한 세균을 알코올 같은 탈색제로 탈색하여도 크리스탈 바이올렛 또는 메틸 바이올렛-요오드 복합물이 세포 속에 그대로 머물러 있게 된다.
그 반대로 그람 음성균은 염색한 후 알코올에 의하여 완전히 탈색된다.
색소-요오드 복합물을 탈색액으로 처리했을 때 그대로 균체 안에 머물러 있게 하는 것은 세포벽의 역할이다. 이 염색법은 기술이 미숙하면 잘못 판정하기 쉬우므로 숙련될 때까지 많은 연습이 필요하다.
또 어린 배양균은 염색성이 좋으나 노쇠기 배양균은 염색성이 좋지 않아 그람양성균이 음성균같이 보일 때가 많으므로 주의하여야 한다.
⑵ 세균의 분류
세균은 세포벽을 가지는데, 세포벽의 구성성분 중 하나인 펩티도글리칸은 진핵생물의 세포벽에는 없는 물질이다.
세균 중에는 세포벽의 펩티도글리칸 층이 두꺼운 것과 얇은 것이 있는데, 두꺼운 펩티도글리칸 층을 가지는 세균은 그람염색을 할 때 사용하는 크리스탈 바이올렛을 세포벽이 흡수하여 탈색 후에도 보유 하므로 보라색을 나타낸다.
반면에, 펩티도글리칸 층이 얇은 세균은 단백질로 된 외피에 싸여 있어서 크리스탈 바이올렛을 함유하는 능력이 약하기 때문에 알코올에 의해 보라색은 탈색되고 나중에 사용되는 사프라닌에 의해 붉은색을 나타낸다. 세포벽이 두꺼운 그램 양성세균은 페니실린에 대해 매우 민감하다. 이것은 페니실린이 세포벽의 주성분인 펩티도글리칸 합성 효소의 작용을 억제하여 세포벽의 생성을 저해하기 때문이다. 이에 비해 그램 음성세균은 세포벽에 단백질 외피가 있어서 페니실린에 민감하지 않으며, 단백질 외피 생성을 억제하는 스트렙토마이신에 민감하다.
⑶ 그람 염색법
덴마크의 세균학자 Christian Gram은 1884년 Gram 염색법에 의하여 세균을 크게 Gram 양성균과 Gram 음성균으로 분류했다.
Gram 염색의 주된 원리는 확실히 밝혀지지 않았지만 현재 가장 일반화된 이론은 Gram 양성균의 세포벽에는 Magnesium ribonuclate라는 산성물질이 있어 염기성 염료인 crystal violet와 결합하여 알코올에 탈색되지 않고 자색(violet color)으로 염색되고 그람 음성균의 세포벽에는 magnesium ribonuclate가 없어 탈색제인 알코올에 의해 탈색된 후 대조 염색인 safranin O에 의해 적색으로 염색된다. 그람 요오드 용액은 매염제로 사용되며 crystal violet이 magnesium ribonuclate와의 결합을 촉진시켜주는 역할을 한다.
그람 염색과 같은 감별 염색방법은 세균학적 측면에서 매우 중요한 기술 중의 하나이다.
(4) 현미경 관찰 사진(원핵생물 슬라이드표본 세트)
Bacillus. Gram-Positive (×800)
Bacillus. Gram-Negative (×800)
Bacteria & Yeast. (×400)
Bacterial Flagella. (×800)
Coccus. (×800)
Streptococcus. (×800)
Escherichia. coil (×800)
Spirillum. (×800)
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Gram staining실험 방법에대해 자세히 알려주세요.
대학에서 보통 그람 양성균은 보통 황색포도상구균, 그람음성으론 대장균으로 실험 많이 합니다. 실험방법은 아래와 같습니다.
■ 그람염색의 원리
그람양성과 그람음성의 세포벽 차이 로 인한 염색차이를 이용한 방법이다. 그람양성균의 세포벽은 여러 층의 펩티도글리칸(peptidoglycan)으로 구성되어 있으나 그람음성균은 한 층의 펩티도글리칸으로 구성되어 있다. 그람염색의 첫 단계인 crystal violet과 iodine 용액을 처리하면 서로 반응하여 불용성 복합체를 형성하게 된다. 그 뒤 탈색제인 alcohol을 처리하면 불용성 복합체가 용해되는데 그람양성균은 세포벽이 두껍기 때문에 내부에 침투해 있던 불용성 복합체들이 모두 빠져나가지 못한 채로 잔존하게 된다(보라색 염색). 하지만, 그람음성균은 얇은 세포벽으로 인해 탈색되어 사프라닌 용액에 의해 분홍색으로 염색되는 것이다.
1. 알코올로 주변 및 슬라이드글라스 세척
2. 슬라이드글라스 앞뒤를 구별하기 위해 테이프를 사용한다.
3. 슬라이드글라스에 증류수 1방울을 올려둔다.
4. 백금이를 화염멸균 한 뒤, 균을 뽑아 슬라이드 글라스 위에 도말한다.
5. 균을 고정하기 위해 슬라이드 글라스를 알코올 램프 위에서 건조시킨다.
6. 크리스탈 바이올렛으로 20초 동안 염색한다.
7. 흐르는 증류수로 세척한다 (2-3초).
8. 물기를 제거한다.
9. 요오드용액으로 60초 동안 염색한다.
10. 95% 알코올로 탈색시킨다.
11. 물기를 제거한다.
12 사프라닌 60초간 염색한다.
13. 흐르는 증류수로 세척한다 (2-3초).
14. 물기를 제거한다.
15. 커버글라스를 올리고 현미경을 관찰한다.
16. 그람양성: 자주색, 그람음성: 적색
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그람 염색법(Gram staining, – 染色)은 1884년 덴마크의 의사인 한스 크리스티안 그람이 고안한 특수 염색법으로 세균류를 염색하기 위해 사용한다.[1] 크게 두 가지 방법이 있다. 대부분의 세균들은 세포벽의 구조에 따라 두 종류로 분류된다. 그람염색법에 의해 보라색으로 염색되는 세균을 그람 양성균이라 부르고, 붉은색으로 염색되는 세균을 그람 음성균이라 부른다.
염색 방법 [ 편집 ]
과거의 그람 염색법에 비해 현대의 그람 염색법은 많은 면에서 개량되었다.
과거의 그람 염색법 [ 편집 ]
허커(Hucker) 원법이라고도 한다. 표본을 아닐린수·겐티아나액(Gentian violet)으로 염색해서 아이오딘-아이오딘화 칼륨으로 매염 처리한 후, 에탄올로 씻어준다.
현대의 그람 염색법 [ 편집 ]
허커(Hucker) 변법이라고도 한다. 과거의 염색법과 차이는 염색 시약을 겐티아나액(Gentian violet) 대신에 크리스탈 바이올렛(Crystal violet)을 사용한다는 점이다. 세균을 슬라이드 글라스에 고정시켜 건조시키고 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 1~ 2분간 염색시킨 뒤 아이오딘-아이오딘화 칼륨에 1분간 고정시킨다. 이후 95% 에틸알코올을 이용하여 탈색시켜주고 이를 물로 씻어준 뒤 사프라닌등 붉은색 계통의 염색약으로 1 ~ 3분간 2차염색을 하고 물에 씻은 뒤 현미경으로 관찰하여 준다.
염색 결과 [ 편집 ]
그람 양성균의 경우 첫 번째 염색약이 에탄올 탈색 과정에서 씻겨나가지 않으므로 보라색을 띠고(두 번째 염색약보다 첫 번째 염색약이 더 진한 색이므로 두 번째 염색약은 이 경우 효과가 없다.), 그람 음성균의 경우는 첫 번째 염색약이 씻겨나가고 두 번째 염색약으로 염색되므로 붉은색을 띠게 된다.
주의 사항 [ 편집 ]
그람 염색 시 그람 양성이 그람 음성으로 염색되는 경우가 있다. 강한 열처리, 지나치게 오랜시간 동안의 탈색으로 인해 CV-I결정이 펩티도글리칸을 빠져나가 사프라닌에 의해 분홍색으로 염색이 된다. 그리고 세균의 배양시간에 따라 정지기, 사멸기와 같은 상태의 세균들은 세포벽이 온전하지 못하므로 제대로 된 염색이 이루어지지 않아 음성으로 염색될 수 있다. 이런 혼란을 방지하기 위해서 염색 시에 여러 조건을 필수적으로 준수해야 한다.
염색법의 원리 [ 편집 ]
보라색으로 염색된 그람 양성균(좌), 분홍색으로 염색된 그람 음성균(우)
그람 양성균은 펩티도글리칸(세포 외피의 50~90%)으로 이루어진 두꺼운 그물코 모양의 세포벽을 가지고 있어 크리스탈 바이올렛에 의해 보라색으로 염색되는 반면, 그람 음성균은 더 얇은 층(세포 외피의 10%)을 가지고 있다.이 층은 자주색 얼룩을 유지하지 않고 사프라닌에 의해 분홍색으로 대조 염색된다. 그람 염색에는 네 가지 기본 단계가 있다.
배양된 박테리아 도말을 열로 고정하고 1차 염색(크리스탈 바이올렛)을 추가한다. 열 고정은 일부 박테리아를 죽이지만, 대부분의 박테리아를 슬라이드에 부착하여 염색 절차 중에 헹궈지지 않도록 하는데 사용된다. 요오드를 첨가한다. 이 요오드는 크리스털 바이올렛과 결합하여 이 결합물을 세포 속에 가두는 역할을 한다. 에탄올 또는 아세톤으로 탈색시킨다. 사프라닌을 사용하여 대조염색[2]. Carbol fuchsin은 혐기성 박테리아를 더 강하게 염색하기 때문에 때때로 사프라닌 대신 사용되지만 대조염색으로는 덜 일반적으로 사용된다.[3]
크리스탈 바이올렛(CV)은 수용액에서 CV+ 및 염화물(Cl-) 이온으로 해리된다. 이 이온은 그람 양성 세포와 그람 음성 세포의 세포벽을 관통한다. CV+ 이온은 박테리아 세포의 음전하를 띤 성분과 상호작용하여 세포를 보라색으로 염색한다.
요오드화물(I- 또는 I-3)은 CV+와 상호작용하여 세포의 내부 및 외부 층 내에서 크리스탈 바이올렛 및 요오드(CV-I)의 큰 복합체를 형성한다. 요오드는 종종 매염제로 언급되지만 CV-I 복합체의 제거를 방지하여 세포를 착색시키는 트래핑제이다.
알코올이나 아세톤과 같은 탈색제를 첨가하면 세포막의 지질과 상호작용한다. 그람 음성균은 외부 지질다당류 막을 상실하고 내부 펩티도글리칸 층이 노출된 채로 남아 있다. CV-I 복합체는 외막과 함께 그람 음성 세포에서 세척된다. 대조적으로, 그람 양성균은 에탄올 처리에서 탈수된다. 큰 CV-I 복합체는 펩티도글리칸의 다층 특성으로 인해 그람 양성 세포 내에 갇히게 된다. 탈색 단계는 매우 중요하며 시간을 정확히 맞춰야 한다. 탈색제가 너무 오래(몇 초) 방치되면 크리스탈 바이올렛 얼룩이 그람 양성 세포와 음성 세포 모두에서 제거된다.
탈색 후 그람 양성균은 보라색을 유지하고 그람 음성균은 보라색을 잃는다. 일반적으로 양전하를 띤 사프라닌 또는 염기성인 대조염색은 탈색된 그람 음성 박테리아에 분홍색 또는 적색을 주기 위해 마지막에 적용된다. 그람 양성 박테리아와 그람 음성 박테리아 모두 대조염색을 선택한다. 그러나 대조염색이 그람 양성균에서 안 보이는 이유는 더 어두운 크리스탈 바이올렛 얼룩 때문이다.
반응상 [ 편집 ]
그람 가변균(Gram-variable)
일부 박테리아는 그람 염색으로 염색한 후 그람 가변 패턴을 생성하며, 이 패턴은 분홍색과 보라색 세포의 혼합으로 보인다.[4][5] Bacillus, Butyrivibrio 및 Clostridium의 배양에서 성장 중 펩티도글리칸 두께의 감소는 그람 음성을 염색하는 세포 수의 증가와 일치한다. 또한, 그람염색을 사용하여 염색한 모든 세균에서 배양연령이 염색결과에 영향을 미칠 수 있다.[5]
그람 불확정균(Gram-indeterminate bacteria)
그람 불확정 세균은 그람 염색에 예측 가능한 반응을 하지 않으므로 그람 양성 또는 그람 음성으로 결정할 수 없다. 예시로는 Mycobacterium bovis, Mycobactrium leprae 및 Mycobacterium tuberculosis를 포함한 많은 종의 Mycobacterium이 포함된다.[6] Mycoplasma 속의 박테리아는 세포막 주위에 세포벽이 없기 때문에 그람법에 의해 염색되지 않으며 세포벽 합성을 표적으로 하는 항생제에 내성이 있다.[7][8]
그람 염색법 의의 [ 편집 ]
그람 음성균은 세포벽이 얇아 페니실린에 대한 반응성이 없다. 즉, 페니실린을 투약해도 효과가 없으며 크리스탈 바이올렛을 흡수해서 가지고 있지 못한다. 하지만 그람양성균은 페니실린으로 치료할 수 있다. 따라서 그람염색은 병원성 세균이 그람염색법에 어떻게 반응하는지 알게 한다. 따라서 병원균에 감염된 경우 어떻게 처리할 것인지를 결정하는데 귀중한 자료가 된다.[9]
어떤 검사입니까?
그람염색은 감염이 의심되는 부위에서 채취한 검체에서 미생물, 특히 세균의 존재를 검출하기 위한 검사실 방법입니다. 존재할 수도 있는 세균의 일반적 형태에 대해 비교적 빠른 결과를 제공합니다. 그람염색은 감염부위에서의 검체를 유리슬라이드에 도말하고 건조시키는 것을 포함합니다. 슬라이드는 그 후 특수 염색으로 처리되어 숙련된 검사실 직원이 현미경으로 검사합니다. 존재할 수도 있는 세균은 현미경 관찰을 하는 동안 색과 모양으로 구분되어 집니다.
색- 일반적으로 세균은 “그람양성”(보라색) 또는 “그람음성”(분홍색) 입니다. 모양- 가장 흔한 모양은 둥글거나(알균) 또는 막대기 모양입니다(막대균)
슬라이드에서 세균의 배치를 관찰해서, 알균은 단독, 쌍 혹은 사련형으로, 포도송이, 또는 사슬모양으로 나타나고, 막대균은 두껍고, 가늘고, 짧고, 길고, 또는 한쪽 끝에 확대된 아포를 가지고 있는 것과 같이 추가적인 정보를 얻을 수도 있습니다. 환자의 백혈구안에(세포 내) 존재하는 세균도 역시 주목됩니다. 그람염색 색과 세균의 모양은 어떤 미생물이 감염을 일으켰을 지에 대한 단서를 제공합니다. 그람양성알균의 예는 포도알균 감염(staph infection)과 관계되는 세균인 포도알균(Staphylococcus aureus)을 포함합니다. 그람음성세균의 예는 많은 요로감염을 일으키는 대장균이다. 진균(효모형 또는 사상균형)은 그람염색으로 초기에 확인이 가능합니다. 그러나 바이러스는 그람염색으로 관찰할 수 없습니다.
검체 채취 과정은 어떻게 됩니까?
감염이 의심되는 부위의 세포 또는 삼출물을 얻는 멸균 면봉을 이용해서 채취합니다. 소변 또는 객담과 같은 검체는 멸균 통에 채취합니다. 어떤 체액은 주사기와 주사침으로 채취할 수 있습니다. 면봉은 배양배지에서 자라고 분리된 세균 검체를 채취할 때 사용할 수도 있습니다.
검사 전 준비사항이 있습니까?
특이사항 없습니다.
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